Misaotra anao nitsidika ny nature.com. Voafetra ny fanohanan'ny CSS amin'ny dikan-tranonkala ampiasainao. Ho an'ny traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa ny dikan-tranonkala farany indrindra (na hanafoana ny fomba fiasa mifanaraka amin'ny Internet Explorer). Fanampin'izany, mba hahazoana antoka fa mitohy ny fanohanana, ity tranonkala ity dia tsy misy styles sy JavaScript.
Ny hozatra taolana dia sela tsy mitovy endrika izay ahitana myofibrils betsaka indrindra, izay matetika sokajiana ho karazany telo amin'ny olombelona: ny iray "miadana" (karazana 1) ary ny roa "haingana" (karazana 2A sy 2X). Na izany aza, mbola tsy mazava tsara ny tsy fitoviana eo amin'ny karazana myofibril nentim-paharazana sy ao anatin'izany. Nampiasa fomba fiasa transcriptomic sy proteomic izahay tamin'ny myofibrils tsirairay 1050 sy 1038 avy amin'ny vastus lateralis olombelona. Ny fandalinana proteomic dia nahitana lehilahy, ary ny fandalinana transcriptomic dia nahitana lehilahy 10 sy vehivavy 2. Ankoatra ny isoforms rojo mavesatra myosin, dia namantatra proteinina metabolika, proteinina ribosomal, ary proteinina junctional sela ho loharanon'ny fiovaovan'ny intermofibril maro refy izahay. Ankoatra izany, na dia eo aza ny famantarana ny vondron-kofehy miadana sy haingana, ny angon-drakitray dia manondro fa ny kofehy karazana 2X dia tsy azo avahana amin'ny fibre hafa mihetsika haingana. Ankoatra izany, ny fanasokajiana mifototra amin'ny rojo mavesatra myosin dia tsy ampy hamaritana ny phenotype myofiber amin'ny myopathies nemaline. Amin'ny ankapobeny, ny angon-drakitray dia manondro tsy fitoviana amin'ny myofiber maro refy, miaraka amin'ny loharanon'ny fiovaovana mihoatra ny isoforms amin'ny rojo mavesatra myosin.
Ny tsy fitoviana eo amin'ny sela dia toetra mampiavaka ny rafitra biolojika rehetra, ahafahan'ny sela manokana mba hanomezana fahafaham-po ny filàn'ny sela sy ny sela samihafa.1 Ny fomba fijery nentim-paharazana momba ny tsy fitoviana eo amin'ny fibre hozatra dia ny hoe ny neuron-motor dia mamaritra ny karazana fibre ao anatin'ny singa motor, ary ny karazana fibre (izany hoe, karazana 1, karazana 2A, ary karazana 2X amin'ny olombelona) dia voafaritry ny toetran'ny isoforms myosin heavy chain (MYH).2 Izany dia niorina tamin'ny tsy fahamarinan'ny pH ATPase,3,4 ary taty aoriana tamin'ny fanehoana molekiolan'ny MYH.5 Na izany aza, miaraka amin'ny famantarana sy ny fanekena ny fibre "mifangaro" izay miara-maneho MYH maromaro amin'ny ampahany samihafa, ny fibre hozatra skeletal dia heverina ho toy ny continuum fa tsy karazana fibre miavaka.6 Na eo aza izany, ny sehatra dia mbola miankina betsaka amin'ny MYH ho toy ny mpanasokajy voalohany amin'ny fanasokajiana myofiber, fomba fijery izay mety ho voataonan'ny fetra sy ny fiangarana manan-danja tamin'ny fandalinana biby mpikiky tany am-boalohany izay ny mombamomba ny fanehoana MYH sy ny karazana fibre dia tsy mitovy amin'ny an'ny olombelona.2 Ny toe-javatra dia vao mainka sarotra noho ny zava-misy fa ny hozatra skeletal olombelona samihafa dia mampiseho karazana fibre isan-karazany.7 Hozatra mifangaro ny vastus lateralis miaraka amin'ny endriky ny fanehoana MYH antonony (ary noho izany dia maneho izany).7 Ankoatra izany, ny fahamoran'ny fakana santionany no mahatonga azy io ho hozatra voadinika tsara indrindra amin'ny olombelona.
Noho izany, ny fanadihadiana tsy mitanila momba ny fahasamihafan'ny fibra hozatra amin'ny alalan'ny fitaovana "omics" mahery vaika dia tena ilaina nefa koa sarotra, noho ny toetra maro nokleary amin'ny fibra hozatra. Na izany aza, ny teknolojia transcriptomics8,9 sy proteomics10 dia nandalo revolisiona teo amin'ny fahatsapana tato anatin'ny taona vitsivitsy noho ny fandrosoana ara-teknolojia isan-karazany, izay nahafahana nandinika ny hozatra amin'ny vahaolana fibra tokana. Vokatr'izany, dia nisy fandrosoana lehibe natao tamin'ny famaritana ny fahasamihafan'ny fibra tokana sy ny fihetsiny amin'ny fientanentanana atrophic sy ny fahanterana11,12,13,14,15,16,17,18. Zava-dehibe ny mahafantatra fa ireo fandrosoana ara-teknolojia ireo dia manana fampiharana ara-pitsaboana, izay ahafahana mamaritra amin'ny antsipiriany sy mazava kokoa ny tsy fanarahan-dalàna mifandraika amin'ny aretina. Ohatra, ny pathophysiology ny nemaline myopathy, iray amin'ireo aretina hozatra nolovaina mahazatra indrindra (MIM 605355 sy MIM 161800), dia sarotra sy mampisafotofoto.19,20 Noho izany, ny famaritana tsara kokoa ny tsy fanarahan-dalàna ny fibra hozatra dia mety hitarika fandrosoana lehibe amin'ny fahatakarantsika ity aretina ity.
Namolavola fomba fanadihadiana transcriptomika sy proteomika amin'ny fibra hozatra tokana nalaina tanana avy amin'ny santionan'ny biopsy olombelona izahay ary nampihatra izany tamin'ny fibra an'arivony, izay nahafahanay nanadihady ny tsy fitoviana sela amin'ny fibra hozatra olombelona. Nandritra ity asa ity, dia nasehonay ny herin'ny phenotyping transcriptomika sy proteomika amin'ny fibra hozatra ary namantatra ny proteinina metabolika, ribosomal, ary sela ho loharano manan-danja amin'ny fiovaovan'ny interfiber. Ankoatra izany, tamin'ny fampiasana ity fomba fiasa proteomika ity, dia nohazavainay ny maha-zava-dehibe ny myopathy nematode amin'ny fibra hozatra tokana, izay naneho fiovana mirindra mankany amin'ny fibra tsy oxidative tsy miankina amin'ny karazana fibra mifototra amin'ny MYH.
Mba handinihana ny tsy fitoviana eo amin'ny fibra hozatra taolana olombelona, dia namorona fomba fiasa roa izahay mba ahafahana mamakafaka ny transcriptome sy ny proteome amin'ny fibra hozatra taolana tokana (Sary 1A sy Sary Fanampiny 1A). Namolavola sy nanatsara dingana metodolojika maromaro izahay, manomboka amin'ny fitahirizana santionany sy ny fiarovana ny fahamarinan'ny RNA sy ny proteinina ka hatramin'ny fanatsarana ny vokatra ho an'ny fomba fiasa tsirairay. Ho an'ny fanadihadiana transcriptome, dia tratra izany tamin'ny alàlan'ny fampidirana barcode molekiola manokana ho an'ny santionany amin'ny dingana voalohany amin'ny fandikana mivadika, izay nahafahan'ny fibra 96 natambatra mba hahazoana fanodinana mahomby. Ny filaharana lalindalina kokoa (±1 tapitrisa famakiana isaky ny fibra) raha oharina amin'ny fomba fiasa sela tokana nentim-paharazana dia nanatsara kokoa ny angon-drakitra transcriptome. 21 Ho an'ny proteomics, dia nampiasa gradient chromatographic fohy (21 minitra) miaraka amin'ny fahazoana angon-drakitra DIA-PASEF amin'ny spectrometer mass timsTOF izahay mba hanatsarana ny halalin'ny proteome sady mitazona ny vokatra avo lenta. 22,23 Mba handinihana ny tsy fitoviana eo amin'ny fibra hozatra salama, dia nojerenay ny transcriptome an'ny fibra tsirairay 1.050 avy amin'ny mpanome olon-dehibe salama 14 sy ny proteome an'ny fibra 1.038 avy amin'ny mpanome olon-dehibe salama 5 (Tabilao Fanampiny 1). Ato amin'ity lahatsoratra ity, ireo angon-drakitra ireo dia antsoina hoe transcriptome sy proteome misy fibra 1.000. Ny fomba fiasanay dia nahita transcript 27.237 sy proteinina 2.983 tao amin'ny fanadihadiana transcriptomic sy proteomic misy fibra 1.000 (Sary 1A, Angon-drakitra Fanampiny 1–2). Rehefa avy nanivana ny angon-drakitra transcriptomic sy proteomic ho an'ny gène hita >1.000 sy sanda manan-kery 50% isaky ny fibra, dia natao ny fanadihadiana bioinformatika manaraka ho an'ny fibra 925 sy 974 tao amin'ny transcriptome sy proteome. Taorian'ny sivana, dia nahitana fototarazo 4257 ± 1557 sy proteinina 2015 ± 234 (salan'isa ± SD) isaky ny fibre, miaraka amin'ny fiovaovana voafetra eo amin'ny tsirairay (Sary Fanampiny 1B–C, Tahiry Fanampiny 3–4). Na izany aza, ny fiovaovana eo amin'ny olona tsirairay dia niharihary kokoa tamin'ireo mpandray anjara, angamba noho ny fahasamihafan'ny vokatra RNA/proteinina eo amin'ny fibre samy hafa halava sy velaran-tany. Ho an'ny ankamaroan'ny proteinina (>2000), ny coefficient of variation dia latsaky ny 20% (Sary Fanampiny 1D). Ireo fomba roa ireo dia nahafahana naka karazana transcripts sy proteinina maro samihafa miaraka amin'ny sonia avo lenta izay manan-danja amin'ny fihenjanan'ny hozatra (ohatra, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Sary Fanampiny 1E–F). Ny ankamaroan'ny endri-javatra voafaritra dia iraisana eo amin'ny angon-drakitra transcriptomic sy proteomic (Sary Fanampiny 1G), ary ny salan'isa UMI/LFQ hamafin'ireo endri-javatra ireo dia mifandray tsara (r = 0.52) (Sary Fanampiny 1H).
Fomba fiasan'ny transcriptomics sy proteomics (noforonina tamin'ny BioRender.com). BD Fiolahana dinamika ho an'ny MYH7, MYH2, ary MYH1, ary fetran'ny kajy ho an'ny fanendrena karazana fibre. E, F Fizarana ny fanehoana MYH manerana ny fibre ao amin'ny angon-drakitra transcriptomics sy proteomics. G, H Tetika Uniform Diversity Approximation and Projection (UMAP) ho an'ny transcriptomics sy proteomics miloko araka ny karazana fibre mifototra amin'ny MYH. I, J Tetika endri-javatra mampiseho ny fanehoana MYH7, MYH2, ary MYH1 ao amin'ny angon-drakitra transcriptomics sy proteomics.
Tany am-piandohana dia nikasa ny hanome karazana kofehy mifototra amin'ny MYH ho an'ny kofehy tsirairay izahay amin'ny alàlan'ny fomba fiasa nohatsaraina izay manararaotra ny fahatsapana avo lenta sy ny elanelana dinamikan'ny fanehoana MYH ao amin'ny angon-drakitra omics. Ny fanadihadiana teo aloha dia nampiasa tokonam-baravarana tsy ara-dalàna mba hanamarihana ny kofehy ho karazana madio 1, karazana 2A, karazana 2X, na mifangaro mifototra amin'ny isan-jaton'ny fanehoana MYHs samihafa 11,14,24. Nampiasa fomba fiasa hafa izahay izay nandaminana ny fanehoana ny kofehy tsirairay araka ny MYHs nampiasainay hanoratana ny kofehy: MYH7, MYH2, ary MYH1, mifanaraka amin'ny kofehy karazana 1, karazana 2A, ary karazana 2X. Avy eo dia nokajianay tamin'ny matematika ny teboka inflection ambany kokoa amin'ny fiolahana tsirairay ary nampiasa izany ho tokonam-baravarana mba hanomezana ny kofehy ho tsara (ambonin'ny tokonam-baravarana) na ratsy (ambanin'ny tokonam-baravarana) ho an'ny MYH tsirairay (Sary 1B–D). Ireo angon-drakitra ireo dia mampiseho fa ny MYH7 (Sary 1B) sy MYH2 (Sary 1C) dia manana mombamomba ny fanehoana on/off miavaka kokoa amin'ny ambaratonga RNA raha oharina amin'ny ambaratonga proteinina. Eny tokoa, eo amin'ny sehatry ny proteinina, vitsy dia vitsy ny fibra tsy naneho ny MYH7, ary tsy nisy fibra nanana fanehoana MYH2 100%. Avy eo dia nampiasa fetran'ny fanehoana voafaritra mialoha izahay mba hanomezana karazana fibra mifototra amin'ny MYH ho an'ny fibra rehetra ao amin'ny angon-drakitra tsirairay. Ohatra, ny fibra MYH7+/MYH2-/MYH1- dia nomena ny karazana 1, raha ny fibra MYH7-/MYH2+/MYH1+ kosa dia nomena ny karazana mifangaro 2A/2X (jereo ny Tabilao Fanampiny 2 raha mila fanazavana feno). Raha natambatra ny fibra rehetra, dia nahita fizarana mitovy amin'ny karazana fibra mifototra amin'ny MYH izahay na amin'ny ambaratonga RNA (Sary 1E) na proteinina (Sary 1F), raha miovaova arakaraka ny olona ny firafitry ny karazana fibra mifototra amin'ny MYH, araka ny nantenaina (Sary Fanampiny 2A). Ny ankamaroan'ny fibra dia nosokajiana ho karazana madio 1 (34–35%) na karazana 2A (36–38%), na dia hita ihany koa aza ny isan'ny fibra mifangaro karazana 2A/2X (16–19%). Ny fahasamihafana manaitra dia ny hoe ny fibre karazana 2X madio dia tsy hita raha tsy amin'ny ambaratongan'ny ARN, fa tsy amin'ny ambaratongan'ny proteinina, izay manondro fa ny fanehoana MYH haingana dia farafahakeliny voafehy amin'ny ampahany aorian'ny fandikana.
Nohamarininay ny fomba fanoratana fibre MYH mifototra amin'ny proteomics tamin'ny fampiasana dot blotting mifototra amin'ny antibody, ary samy nahazo fifanarahana 100% tamin'ny famantarana ny fibre karazana 1 sy karazana 2A madio (jereo ny Sary Fanampiny 2B). Na izany aza, ny fomba fiasa mifototra amin'ny proteomics dia saro-pady kokoa, mahomby kokoa amin'ny famantarana ny fibre mifangaro, ary ny fandrefesana ny isan-jaton'ny gène MYH tsirairay ao amin'ny fibre tsirairay. Ireo angon-drakitra ireo dia mampiseho ny fahombiazan'ny fampiasana fomba fiasa mifototra amin'ny omics tsy miangatra sy saro-pady mba hamantarana ny karazana fibre hozatra skeletal.
Avy eo dia nampiasa ny fampahalalana mitambatra nomen'ny transcriptomics sy proteomics izahay mba hanasokajiana amin'ny fomba tsy miangatra ny myofibers mifototra amin'ny transcriptome na proteome feno. Tamin'ny fampiasana ny fomba fanamorana sy projection manifold mitovy (UMAP) mba hampihenana ny refy ho singa lehibe enina (Sary Fanampiny 3A–B), dia afaka nahita ny fiovaovan'ny myofiber ao amin'ny transcriptome (Sary 1G) sy ny proteome (Sary 1H) izahay. Tsara homarihina fa ny myofibers dia tsy natambatra araka ny mpandray anjara (Sary Fanampiny 3C–D) na ny andro fitsapana (Sary Fanampiny 3E) na tao amin'ny angon-drakitra transcriptomics na proteomics, izay manondro fa ny fiovaovan'ny fibra hozatra ao anatin'ny olona iray dia ambony noho ny fiovaovan'ny olona iray. Tao amin'ny teti-dratsin'ny UMAP, dia nisy vondrona roa miavaka maneho ny myofibers "haingana" sy "miadana" nipoitra (Sary 1G–H). Niangona teo amin'ny tsato-kazo tsara an'ny UMAP1 ny myofibers MYH7+ (miadana), raha toa kosa ka niangona teo amin'ny tsato-kazo ratsy an'ny UMAP1 ny myofibers MYH2+ sy MYH1+ (haingana). Na izany aza, tsy nisy fanavahana natao teo amin'ny karazana fibre fast-twitch (izany hoe, karazana 2A, karazana 2X, na 2A/2X mifangaro) mifototra amin'ny fanehoana MYH, izay manambara fa ny fanehoana MYH1 (Sary 1I–J) na marika myofiber 2X mahazatra hafa toy ny ACTN3 na MYLK2 (Sary Fanampiny 4A–B) dia tsy manavaka ny karazana myofiber samihafa rehefa jerena ny transcriptome na proteome manontolo. Ankoatra izany, raha ampitahaina amin'ny MYH2 sy MYH7, dia vitsy ny transcripts na proteinina mifandray tsara amin'ny MYH1 (Sary Fanampiny 4C–H), izay manambara fa ny habetsahan'ny MYH1 dia tsy maneho tanteraka ny transcriptome/proteome myofiber. Toy izany koa ny fehin-kevitra azo rehefa nanombana ny fifangaroan'ny fanehoana ireo isoforma MYH telo amin'ny ambaratonga UMAP (Sary fanampiny 4I–J). Noho izany, na dia azo fantarina amin'ny ambaratonga transcript aza ny fibre 2X mifototra amin'ny fandrefesana MYH fotsiny, dia tsy azo avahana amin'ny fibre haingana hafa ny fibre MYH1+ rehefa jerena ny transcriptome na proteome manontolo.
Ho fikarohana voalohany momba ny tsy fitoviana amin'ny fibre miadana ankoatra ny MYH, dia nanombana proteinina efatra voafaritra manokana ho an'ny karazana fibre miadana izahay: TPM3, TNNT1, MYL3, ary ATP2A22. Ny karazana fibre miadana dia naneho fifandraisana Pearson avo lenta, na dia tsy tonga lafatra aza, amin'ny MYH7 amin'ny transcriptomics (Sary Fanampiny 5A) sy proteomics (Sary Fanampiny 5B). Eo amin'ny 25% sy 33% eo ho eo amin'ny fibre miadana no tsy voasokajy ho fibre miadana madio araka ny karazana gène/proteinina rehetra ao amin'ny transcriptomics (Sary Fanampiny 5C) sy proteomics (Sary Fanampiny 5D). Noho izany, ny fanasokajiana ny fibre miadana mifototra amin'ny karazana gène/proteinina maromaro dia miteraka fahasarotana fanampiny, na dia ho an'ny proteinina fantatra fa manokana amin'ny karazana fibre aza. Izany dia manondro fa ny fanasokajiana ny fibre mifototra amin'ny isoforms amin'ny fianakaviana gène/proteinina tokana dia mety tsy haneho tsara ny tena tsy fitoviana amin'ny fibre hozatra.
Mba handinihana bebe kokoa ny fiovaovan'ny phenotype amin'ny fibra hozatra taolana olombelona amin'ny ambaratongan'ny modely omics manontolo, dia nanao fampihenana ny refy tsy mitanila ny angon-drakitra izahay tamin'ny fampiasana ny fanadihadiana singa fototra (PCA) (Sary 2A). Mitovy amin'ny teti-dratsin'ny UMAP, na ny mpandray anjara na ny andro fitsapana dia tsy nisy fiantraikany tamin'ny fivondronan'ny fibra tamin'ny ambaratonga PCA (Sary Fanampiny 6A–C). Tao amin'ireo angon-drakitra roa ireo, ny karazana fibra mifototra amin'ny MYH dia nohazavain'ny PC2, izay naneho vondron'ny fibra karazana 1 miadana sy vondron'ny faharoa misy karazana 2A miadana, karazana 2X, ary fibra 2A/2X mifangaro (Sary 2A). Tao amin'ireo angon-drakitra roa ireo, ireo vondron'olona roa ireo dia mifandray amin'ny alalan'ny fibra karazana 1/2A mifangaro vitsivitsy. Araka ny nantenaina, ny fanadihadiana tafahoatra ny mpamily PC lehibe dia nanamafy fa ny PC2 dia tarihin'ny sonia mifampitohy sy metabolika (Sary 2B sy Sary Fanampiny 6D–E, Andian-drakitra Fanampiny 5–6). Amin'ny ankapobeny, ny karazana fibre mifototra amin'ny MYH dia hita fa ampy hanazavana ny fiovaovana mitohy manaraka ny PC2, afa-tsy ireo antsoina hoe fibre 2X izay niparitaka nanerana ny transcriptome tao anatin'ny cluster haingana.
A. Tetikasa famakafakana singa fototra (PCA) an'ny angon-drakitra transcriptome sy proteome miloko araka ny karazana fibre mifototra amin'ny MYH. B. Famakafakana fanatsarana ny mpamily transcriptome sy proteinina ao amin'ny PC2 sy PC1. Natao tamin'ny fampiasana ny fonosana clusterProfiler sy ny sandan'ny p nanitsy an'i Benjamini-Hochberg ny famakafakana statistika. C, D. Tetikasa PCA miloko araka ny teny ontolojia gène adhesion intercellular (GO) ao amin'ny teny transcriptome sy costamere GO ao amin'ny proteome. Ny zana-tsipìka dia maneho ny mpamily transcriptome sy proteinina ary ny lalana alehany. E, F. Tetikasa fanatonana sy projection manifold tokana (UMAP) misy endri-javatra mifandraika amin'ny klinika mampiseho ny gradients fanehoana tsy miankina amin'ny karazana fibre miadana/haingana. G, H. Fifandraisana eo amin'ny mpamily PC2 sy PC1 ao amin'ny transcriptome sy proteome.
Tsy nampoizina fa ny karazana myofiber mifototra amin'ny MYH dia nanazava ny ambaratonga faharoa ambony indrindra amin'ny fiovaovana (PC2), izay manambara fa ny singa biolojika hafa tsy mifandraika amin'ny karazana myofiber mifototra amin'ny MYH (PC1) dia mitana anjara toerana lehibe amin'ny fandrindrana ny tsy fitoviana eo amin'ny fibre hozatra. Ny fanadihadiana tafahoatra momba ireo mpamily ambony ao amin'ny PC1 dia naneho fa ny fiovaovana ao amin'ny PC1 dia voafaritry ny fifikirana sela-sela sy ny votoatin'ny ribosome ao amin'ny transcriptome, ary ny costameres sy ny proteinina ribosomal ao amin'ny proteome (Sary 2B sy Sary Fanampiny 6D–E, Andian-drakitra Fanampiny 7). Ao amin'ny hozatra, ny costameres dia mampifandray ny kapila Z amin'ny sarcolemma ary mandray anjara amin'ny fandefasana hery sy ny famantarana. Ny sary PCA 25 misy fanamarihana mampiasa ny fifikirana sela-sela (transcriptome, Sary 2C) sy ny endriky ny costamere (proteome, Sary 2D) dia naneho fiovana mahery vaika teo amin'ny ankavia ao amin'ny PC1, izay manondro fa ireo endri-javatra ireo dia manankarena amin'ny fibre sasany.
Ny fandinihana amin'ny antsipiriany kokoa ny fivondronan'ny myofiber amin'ny ambaratonga UMAP dia naneho fa ny ankamaroan'ny endri-javatra dia naneho gradient fanehoana mifototra amin'ny karazana myofiber MYH fa tsy manokana ho an'ny subcluster myofiber. Hita io fitohizana io ho an'ny gène maromaro mifandraika amin'ny toe-javatra pathological (Sary 2E), toy ny CHCHD10 (aretin'ny neuromuscular), SLIT3 (atrophy hozatra), CTDNEP1 (aretin'ny hozatra). Hita ihany koa io fitohizana io manerana ny proteome, anisan'izany ny proteinina mifandraika amin'ny aretin'ny neurolojia (UGDH), ny famantarana insuline (PHIP), ary ny transcription (HIST1H2AB) (Sary 2F). Raha fintinina, ireo angon-drakitra ireo dia manondro ny fitohizan'ny tsy fitoviana amin'ny fihetsehana miadana/haingana tsy miankina amin'ny karazana fibre amin'ny myofibers samihafa.
Mahaliana fa ny fototarazo mpamily ao amin'ny PC2 dia naneho fifandraisana tsara amin'ny transcriptome-proteome (r = 0.663) (Sary 2G), izay manambara fa ny karazana fibre mihetsika miadana sy haingana, ary indrindra ny toetra mifehy sy metabolika amin'ny fibre hozatra, dia fehezin'ny fandikana. Na izany aza, ny fototarazo mpamily ao amin'ny PC1 dia tsy naneho fifandraisana amin'ny transcriptome-proteome (r = -0.027) (Sary 2H), izay manambara fa ny fiovaovana tsy misy ifandraisany amin'ny karazana fibre mihetsika miadana/haingana dia fehezin'ny ankamaroany aorian'ny fandikana. Satria ny fiovaovana ao amin'ny PC1 dia nohazavaina voalohany indrindra tamin'ny alalan'ny teny ontolojian'ny fototarazo ribosomal, ary satria ny ribosomes dia mitana anjara toerana lehibe sy manokana ao amin'ny sela amin'ny alàlan'ny fandraisana anjara mavitrika sy ny fiantraikany amin'ny fandikana proteinina,31 dia nanomboka nanadihady ity tsy fitoviana tsy nampoizina amin'ny ribosomal ity izahay.
Nolokoinay voalohany ny tetika famakafakana singa fototra proteomics araka ny habetsahan'ny proteinina ao amin'ny teny GOCC hoe "cytoplasmic ribosome" (Sary 3A). Na dia manankarena amin'ny lafiny tsara amin'ny PC1 aza ity teny ity, ka miteraka gradient kely, ny proteinina ribosomal dia mitarika ny fizarazarana amin'ny lafiny roa amin'ny PC1 (Sary 3A). Ny proteinina ribosomal manankarena amin'ny lafiny ratsy amin'ny PC1 dia nahitana ny RPL18, RPS18, ary RPS13 (Sary 3B), raha ny RPL31, RPL35, ary RPL38 (Sary 3C) kosa no mpamily lehibe amin'ny lafiny tsara amin'ny PC1. Mahaliana fa ny RPL38 sy RPS13 dia hita betsaka ao amin'ny hozatra taolana raha oharina amin'ny sela hafa (Sary Fanampiny 7A). Ireo sonia ribosomal miavaka ao amin'ny PC1 dia tsy hita tao amin'ny transcriptome (Sary Fanampiny 7B), izay manondro ny fanaraha-maso aorian'ny fandikana.
A. Tetika fanadihadiana singa fototra (PCA) miloko araka ny teny ontolojian'ny fototarazo ribosomal cytoplasmika (GO) manerana ny proteome. Ny zana-tsipìka dia manondro ny lalana misy ny fiovaovan'ny proteinina ao amin'ny tetika PCA. Ny halavan'ny tsipika dia mifanaraka amin'ny isa singa fototra ho an'ny proteinina iray. B, C. Tetika endri-javatra PCA ho an'ny RPS13 sy RPL38. D. Fanadihadiana tsy misy fanaraha-maso ny fivondronan'ny proteinina ribosomal cytoplasmika. E. Modely ara-drafitry ny ribosome 80S (PDB: 4V6X) manasongadina ny proteinina ribosomal miaraka amin'ny habetsahana samihafa ao amin'ny fibre hozatra taolana. F. Proteinina ribosomal miaraka amin'ny stoichiometry samihafa eo akaikin'ny fantsona fivoahan'ny mRNA.
Efa naroso teo aloha ny foto-kevitra momba ny tsy fitoviana sy ny fanasokajiana ny ribosomal, izay ahafahan'ny fisian'ny vondron'olona ribosome miavaka (tsy fitoviana ribosomal) mitaona mivantana ny fandikana proteinina amin'ny sela samihafa32 sy sela33 amin'ny alàlan'ny fandikana voafantina ny vondron'ny transcript mRNA manokana34 (fanasokajiana ny ribosomal). Mba hamantarana ny vondron'olona proteinina ribosomal miara-miseho ao amin'ny fibre hozatra taolana, dia nanao fanadihadiana momba ny fivondronana ambaratongam-pahefana tsy misy fanaraha-maso momba ny proteinina ribosomal ao amin'ny proteome izahay (Sary 3D, Tahiry Fanampiny 8). Araka ny nantenaina, ny proteinina ribosomal dia tsy nivondrona araka ny karazana fibre mifototra amin'ny MYH. Na izany aza, dia nahita vondrona proteinina ribosomal telo miavaka izahay; ny vondrona voalohany (ribosomal_cluster_1) dia miara-miasa amin'ny RPL38 ary noho izany dia nitombo ny fanehoana azy tao amin'ny fibre misy mombamomba ny PC1 tsara. Ny vondrona faharoa (ribosomal_cluster_2) dia miara-miasa amin'ny RPS13 ary avo lenta ao amin'ny fibre misy mombamomba ny PC1 ratsy. Ny vondrona fahatelo (ribosomal_cluster_3) dia tsy mampiseho fanehoana samihafa mirindra ao amin'ny fibra hozatra taolana ary azo heverina ho proteinina ribosomal "fototra" ho an'ny hozatra taolana. Samy ahitana proteinina ribosomal ny vondrona ribosomal 1 sy 2 izay efa naseho teo aloha fa mifehy ny fandikan-teny hafa (ohatra, RPL10A, RPL38, RPS19, ary RPS25) ary misy fiantraikany amin'ny fivoarana (ohatra, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Mifanaraka amin'ny valin'ny PCA, ny fanehoana tsy mitovy amin'ireo proteinina ribosomal ireo manerana ny fibre dia naneho ihany koa ny fitohizana (Sary Fanampiny 7C).
Mba hijerena ny toerana misy ireo proteinina ribosomal heterogeneous ao anatin'ny ribosome, dia nampiasa modely ara-drafitra an'ny ribosome 80S an'ny olombelona izahay (Protein Data Bank: 4V6X) (Sary 3E). Rehefa avy nanasaraka ireo proteinina ribosomal an'ny vondrona ribosomal samihafa, dia tsy nifanaraka tsara ny toerana misy azy ireo, izay manondro fa tsy nahavita nanome fanatsarana ho an'ny faritra/ampahany sasany amin'ny ribosome ny fomba fiasanay. Mahaliana anefa fa ny ampahany amin'ny proteinina subunit lehibe ao amin'ny vondrona 2 dia ambany noho ny ao amin'ny vondrona 1 sy 3 (Sary Fanampiny 7D). Hitanay fa ny proteinina misy stoichiometry niova ao amin'ny fibre hozatra taolana dia hita indrindra amin'ny velaran'ny ribosome (Sary 3E), mifanaraka amin'ny fahafahany mifandray amin'ny singa fidirana ribosome anatiny (IRES) ao amin'ny vondron'olona mRNA samihafa, ka mandrindra ny fandikan-teny voafantina. 40, 41 Ankoatra izany, proteinina maro misy stoichiometry niova ao amin'ny fibre hozatra taolana no hita akaikin'ny faritra miasa toy ny tonelina fivoahan'ny mRNA (Sary 3F), izay mandrindra ny fanalavana ny fandikan-teny sy ny fijanonan'ny peptides manokana. 42 Raha fintinina, ny angon-drakitray dia manondro fa ny stoichiometry amin'ny proteinina ribosomal hozatry ny taolana dia mampiseho tsy fitoviana, ka miteraka fahasamihafana eo amin'ny fibra hozatra taolana.
Avy eo dia nanomboka namantatra ny mari-pamantarana fibre mihetsika haingana sy miadana izahay ary nandinika ny fomba fiasan'ny fandikana azy ireo. Rehefa mampitaha ny vondron-fibre mihetsika haingana sy miadana voafaritry ny UMAP ao amin'ny angon-drakitra roa (Sary 1G–H sy 4A–B), ny fanadihadiana transcriptomic sy proteomic dia namantatra endri-javatra 1366 sy 804 izay samy hafa be (Sary 4A–B, Angon-drakitra Fanampiny 9–12). Nahita ny fahasamihafana andrasana amin'ny mari-pamantarana mifandraika amin'ny sarcomeres (ohatra, tropomyosin sy troponin), ny fampifandraisana excitation-contraction (SERCA isoforms), ary ny metabolisman'ny angovo (ohatra, ALDOA sy CKB). Ankoatra izany, ny transcripts sy ny proteinina mifehy ny ubiquitination proteinina dia naneho tamin'ny fomba samihafa tao amin'ny fibre mihetsika haingana sy miadana (ohatra, USP54, SH3RF2, USP28, ary USP48) (Sary 4A–B). Ankoatra izany, ny fototarazon'ny proteinina mikraoba RP11-451G4.2 (DWORF), izay efa naseho teo aloha fa maneho amin'ny fomba samihafa amin'ny karazana fibra hozatry ny zanak'ondry43 ary mampitombo ny asan'ny SERCA ao amin'ny hozatry ny fo44, dia niakatra be tao amin'ny fibra hozatra miadana (Sary 4A). Toy izany koa, teo amin'ny sehatry ny fibra tsirairay, dia nisy fahasamihafana lehibe hita tamin'ny sonia fantatra toy ny isoforms lactate dehydrogenase mifandraika amin'ny metabolisma (LDHA sy LDHB, Sary 4C ary Sary Fanampiny 8A)45,46 ary koa sonia manokana amin'ny karazana fibra tsy fantatra teo aloha (toy ny IRX3, USP54, USP28, ary DPYSL3) (Sary 4C). Nisy fifanindriana lehibe teo amin'ny endri-javatra maneho amin'ny fomba samihafa teo amin'ny angon-drakitra transcriptomic sy proteomic (Sary Fanampiny 8B), ary koa ny fifandraisan'ny fiovan'ny vala izay tarihin'ny fanehoana samihafa kokoa ny endri-javatra sarcomere (Sary Fanampiny 8C). Tsara homarihina fa ny sonia sasany (ohatra USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) dia naneho fitsipika matanjaka taorian'ny fandikana amin'ny ambaratonga proteomika ihany ary nanana mombamomba ny fanehoana manokana ho an'ny karazana fibre twitch miadana/haingana (Sary Fanampiny 8C).
Tetika volkano A sy B mampitaha ireo vondrona miadana sy haingana izay voafaritra tamin'ny alalan'ny tetika fanamorana sy projection manifold mitovy (UMAP) ao amin'ny Sary 1G–H. Ny teboka miloko dia maneho ny transcripts na proteinina izay samy hafa be amin'ny FDR < 0.05, ary ny teboka maizina kokoa dia maneho ny transcripts na proteinina izay samy hafa be amin'ny fiovan'ny log > 1. Ny fanadihadiana statistika roa tonta dia natao tamin'ny fampiasana ny fitsapana DESeq2 Wald miaraka amin'ny sanda p namboarina Benjamini-Hochberg (transcriptomics) na ny fomba modely linear Limma miaraka amin'ny fanadihadiana Bayesian empirika arahin'ny fanitsiana Benjamini-Hochberg ho an'ny fampitahana marobe (proteomics). C Tetika famantarana ny gène na proteinina voafantina izay samy hafa ny fanehoany eo amin'ny fibre miadana sy haingana. D Fanadihadiana fanatsarana ny transcripts sy proteinina izay samy hafa ny fanehoany. Ny sanda mifanindry dia hatsaraina amin'ny angon-drakitra roa, ny sanda transcriptome dia hatsaraina ao amin'ny transcriptome ihany, ary ny sanda proteome dia hatsaraina ao amin'ny proteome ihany. Ny fanadihadiana statistika dia natao tamin'ny fampiasana ny fonosana clusterProfiler miaraka amin'ny sanda p namboarina Benjamini-Hochberg. E. Ireo singa fandikana manokana ho an'ny karazana fibre dia voafaritry ny SCENIC mifototra amin'ny isa manokana momba ny mpandrindra avy amin'ny SCENIC sy ny fanehoana mRNA samihafa eo amin'ny karazana fibre. F. Famaritana ny mombamomba ireo singa fandikana voafantina izay samy hafa ny fanehoana azy eo amin'ny fibre miadana sy haingana.
Avy eo dia nanao fanadihadiana momba ny fanehoana tafahoatra ny fototarazo sy proteinina izay samy hafa ny fanehoana azy izahay (Sary 4D, Andian-drakitra Fanampiny 13). Ny fanatsarana ny lalan-kizorana ho an'ireo endri-javatra izay tsy mitovy eo amin'ireo angon-drakitra roa ireo dia naneho fahasamihafana andrasana, toy ny β-oxidation asidra matavy sy ny fizotran'ny metabolisman'ny ketone (fibre miadana), ny myofilament/fihenan'ny hozatra (fibre haingana sy miadana), ary ny fizotran'ny katabolika gliosida (fibre haingana). Niakatra ihany koa ny asan'ny serine/threonine protein phosphatase tao amin'ny fibre haingana, vokatry ny endri-javatra toy ny subunits phosphatase regulatory sy catalytic (PPP3CB, PPP1R3D, ary PPP1R3A), izay fantatra fa mandrindra ny metabolisman'ny glycogen (47) (Sary Fanampiny 8D–E). Ny lalan-kafa nanankarena tao amin'ny fibre haingana dia nahitana ny vatana fanodinana (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) tao amin'ny proteome (Sary Fanampiny 8F), izay mety ho tafiditra amin'ny fanaraha-maso aorian'ny fandikana (48), ary ny asan'ny singa fandikana (SREBF1, RXRG, RORA) tao amin'ny transcriptome (Sary Fanampiny 8G). Ny fibre miadana dia nanankarena tamin'ny asan'ny oxidoreductase (BDH1, DCXR, TXN2) (Sary Fanampiny 8H), ny fifamatoran'ny amide (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Sary Fanampiny 8I), ny matrisy extracellular (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Sary Fanampiny 8J), ary ny asan'ny receptor-ligand (FNDC5, SPX, NENF) (Sary Fanampiny 8K).
Mba hahazoana fahatakarana bebe kokoa momba ny fandrindrana ny fandikana izay fototry ny toetran'ny karazana fibra hozatra miadana/haingana, dia nanao fanadihadiana momba ny fanatsarana ny singa fandikana izahay tamin'ny fampiasana SCENIC49 (Andiana angon-drakitra fanampiny 14). Maro amin'ireo singa fandikana no nanankarena be teo amin'ny fibra hozatra haingana sy miadana (Sary 4E). Anisan'izany ny singa fandikana toy ny MAFA, izay efa nampifandraisina tamin'ny fivoaran'ny fibra hozatra haingana,50 ary koa ireo singa fandikana maromaro izay tsy mifandray amin'ny fandaharan'asa fototarazo manokana momba ny karazana fibra hozatra. Anisan'ireo, ny PITX1, EGR1, ary MYF6 no singa fandikana manankarena indrindra amin'ny fibra hozatra haingana (Sary 4E). Mifanohitra amin'izany, ny ZSCAN30 sy EPAS1 (fantatra ihany koa amin'ny hoe HIF2A) no singa fandikana manankarena indrindra amin'ny fibra hozatra miadana (Sary 4E). Mifanaraka amin'izany, ny MAFA dia naseho tamin'ny ambaratonga ambony kokoa tao amin'ny faritra UMAP mifanaraka amin'ny fibra hozatra haingana, raha ny EPAS1 kosa dia nanana lamina fanehoana mifanohitra amin'izany (Sary 4F).
Ankoatra ireo fototarazo mpamoaka proteinina fantatra, dia misy karazana RNA maro tsy mpamoaka izay mety ho tafiditra amin'ny fandrindrana ny fivoaran'ny olombelona sy ny aretina. 51, 52 Ao amin'ny angon-drakitra transcriptome, RNA tsy mpamoaka maromaro no mampiseho ny maha-manokana ny karazana fibre (Sary 5A sy ny angon-drakitra fanampiny 15), anisan'izany ny LINC01405, izay tena manokana ho an'ny fibre miadana ary voalaza fa mihena amin'ny hozatra avy amin'ny marary voan'ny myopathy mitochondrial. 53 Mifanohitra amin'izany, ny RP11-255P5.3, mifanaraka amin'ny fototarazo lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, dia mampiseho ny maha-manokana ny karazana fibre haingana. Samy mampiseho ny maha-manokana ny hozatra taolana ny LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) sy ny RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) (Sary Fanampiny 9A–B) ary tsy manana fototarazo mampihenjana fantatra ao anatin'ny manodidina ny genomic 1 Mb, izay manondro fa mitana anjara toerana manokana amin'ny fandrindrana ny karazana fibre izy ireo fa tsy mandrindra ny fototarazo mampihenjana mifanila aminy. Ny mombamomba ny fanehoana manokana ny karazana fibre miadana/haingana an'ny LINC01405 sy RP11-255P5.3, tsirairay avy, dia nohamafisina tamin'ny fampiasana RNAscope (Sary 5B–C).
A. Voafetra be ao amin'ny fibre hozatra mihetsika miadana sy haingana ny fandikana RNA tsy misy kaody. B. Sary RNAscope maneho ny maha-manokana ny karazana fibre mihetsika miadana sy haingana an'ny LINC01405 sy RP11-255P5.3. Bara mizana = 50 μm. C. Fandrefesana ny fanehoana RNA tsy misy kaody manokana amin'ny karazana myofiber araka ny voafaritry ny RNAscope (n = biopsies 3 avy amin'ny olona tsy miankina, mampitaha ny fibre hozatra haingana sy miadana ao anatin'ny olona tsirairay). Natao tamin'ny fampiasana fitsapana t-Student roa rambony ny fanadihadiana statistika. Ny kisarisary boaty dia mampiseho ny mediana sy ny quartiles voalohany sy fahatelo, miaraka amin'ny volombava manondro ny sanda kely indrindra sy ambony indrindra. D. Fomba famantarana proteinina mikraoba de novo (noforonina tamin'ny BioRender.com). E. Ny proteinina mikraoba LINC01405_ORF408:17441:17358 dia aseho manokana ao amin'ny fibre hozatra taolana miadana (n=biopsy 5 avy amin'ny mpandray anjara tsy miankina, mampitaha ny fibre hozatra haingana sy miadana ao amin'ny mpandray anjara tsirairay). Natao tamin'ny alalan'ny fomba modely Limm linear miaraka amin'ny fomba fiasa Bayesian empirika ny fanadihadiana statistika, narahin'ny fomba Benjamini-Hochberg ho an'ny fampitahana marobe miaraka amin'ny fanitsiana ny sandan'ny p. Ny kisarisary boaty dia mampiseho ny median, ny quartile voalohany ary ny fahatelo, miaraka amin'ny volombava manondro ny sanda ambony indrindra/kely indrindra.
Vao haingana, ireo fanadihadiana dia naneho fa maro amin'ireo transcripts tsy misy kaody no mandika ireo proteinina mikraoba voadika, izay ny sasany amin'izy ireo dia mandrindra ny fiasan'ny hozatra. 44, 55 Mba hamantarana ireo proteinina mikraoba manana karazana fibre manokana, dia nokarohinay ny angon-drakitra proteome fibre 1000 anay tamin'ny fampiasana rakitra FASTA namboarina manokana misy ny filaharan'ny transcripts tsy misy kaody (n = 305) hita ao amin'ny angon-drakitra transcriptome fibre 1000 (Sary 5D). Namantatra proteinina mikraoba 197 avy amin'ny transcripts 22 samihafa izahay, 71 amin'izy ireo no voafehy amin'ny fomba samihafa eo amin'ny fibre hozatra miadana sy haingana (Sary Fanampiny 9C sy Andian-drakitra Fanampiny 16). Ho an'ny LINC01405, dia hita fa misy vokatra proteinina mikraoba telo, ny iray amin'izy ireo dia naneho fibre manokana miadana mitovy amin'ny transcript-ny (Sary 5E sy Sary Fanampiny 9D). Noho izany, dia namantatra ny LINC01405 ho toy ny gène mandika proteinina mikraoba manokana ho an'ny fibre hozatra miadana.
Namolavola fomba fiasa feno ho an'ny famaritana proteomika amin'ny ambaratonga lehibe amin'ny fibra hozatra tsirairay izahay ary namantatra ireo mpandrindra ny tsy fitoviana amin'ny fibra amin'ny toe-pahasalamana salama. Nampiharinay ity fomba fiasa ity mba hahatakarana ny fiantraikan'ny myopathie nemaline amin'ny tsy fitoviana amin'ny fibra hozatra skeletal. Ny myopathie nemaline dia aretina hozatra nolovaina izay miteraka fahalemena hozatra ary, amin'ny ankizy voakasik'izany, dia misy fahasarotana isan-karazany ao anatin'izany ny fahasahiranana amin'ny taovam-pisefoana, scoliosis, ary ny fivezivezen'ny rantsambatana voafetra. 19,20 Matetika, amin'ny myopathie nemaline, ny fiovaovan'ny pathogenic amin'ny fototarazo toy ny actin alpha 1 (ACTA1) dia miteraka firafitry ny myofiber fibre miadana, na dia tsy mitovy aza io fiantraikany io. Ny iray amin'ireo maningana dia ny troponin T1 nemaline myopathy (TNNT1), izay manana fibra haingana betsaka. Noho izany, ny fahatakarana tsara kokoa ny tsy fitoviana fototra amin'ny tsy fitoviana amin'ny fibra hozatra skeletal hita amin'ny myopathie nemaline dia mety hanampy amin'ny famahana ny fifandraisana sarotra misy eo amin'ireo aretina ireo sy ny karazana myofiber.
Raha ampitahaina amin'ny olona salama (n=3 isaky ny vondrona), ny myofibers nalaina avy amin'ny marary myopathy nemaline izay manana fiovan'ny fototarazo ACTA1 sy TNNT1 dia naneho atrophy na dystrophy myofiber miavaka (Sary 6A, Tabilao Fanampiny 3). Izany dia niteraka fanamby ara-teknika lehibe ho an'ny fanadihadiana proteomika noho ny habetsahan'ny fitaovana azo ampiasaina voafetra. Na teo aza izany, dia afaka nahita proteinina 2485 tao amin'ny myofibers taolana 272 izahay. Rehefa avy nanivana proteinina 1000 farafahakeliny isaky ny fibre, dia nodinihina ny fibre 250 taorian'izay. Rehefa avy nanivana, dia proteinina 1573 ± 359 isaky ny fibre no nodinihina (Sary Fanampiny 10A, Andian-drakitra Fanampiny 17–18). Tsara homarihina fa na dia teo aza ny fihenan'ny haben'ny fibre, dia nihena kely fotsiny ny halalin'ny proteome tamin'ny santionan'ny marary myopathy nemaline. Ankoatra izany, ny fanodinana ireo angon-drakitra ireo amin'ny fampiasana ny rakitra FASTA anay manokana (anisan'izany ny transcripts tsy coding) dia namela anay hamantatra proteinina mikraoba dimy ao amin'ny myofibers taolana avy amin'ny marary myopathy nemaline (Supplementary Data Set 19). Ny elanelana dinamikan'ny proteome dia mivelatra kokoa, ary ny proteinina manontolo ao amin'ny vondrona fanaraha-maso dia mifandray tsara amin'ny valin'ny fanadihadiana proteome 1000-fiber teo aloha (Sary Fanampiny 10B–C).
A. Sary mikroskopika mampiseho ny fihenan'ny fibra na ny dystrophy ary ny fisian'ny karazana fibra samihafa mifototra amin'ny MYH amin'ny myopathie nemaline ACTA1 sy TNNT1 (NM). Bara mizana = 100 μm. Mba hahazoana antoka fa azo averina ny fandokoana amin'ny marary ACTA1 sy TNNT1, dia nolokoina in-droa na intelo (fizarana efatra isaky ny tranga) ny biopsie marary telo talohan'ny nisafidianana sary maneho izany. B. Ny tahan'ny karazana fibra amin'ny mpandray anjara mifototra amin'ny MYH. C. Tetika fanadihadiana singa fototra (PCA) amin'ny fibra hozatra amin'ny marary voan'ny myopathie nemaline sy ny fanaraha-maso. D. Fibra hozatra avy amin'ny marary voan'ny myopathie nemaline sy ny fanaraha-maso aseho amin'ny tetika PCA voafaritra avy amin'ny fibra 1000 nodinihina tao amin'ny Sary 2. Ohatra, tetika volkano mampitaha ny fahasamihafana eo amin'ny mpandray anjara amin'ny myopathie nemaline ACTA1 sy TNNT1 sy ny fanaraha-maso, ary eo amin'ny mpandray anjara amin'ny myopathie nemaline ACTA1 sy TNNT1. Ny faribolana miloko dia manondro proteinina izay samy hafa be amin'ny π < 0.05, ary ny teboka maizina dia manondro proteinina izay samy hafa be amin'ny FDR < 0.05. Ny fanadihadiana statistika dia natao tamin'ny fampiasana ny fomba modely Limma linear sy ny fomba Bayesian empirika, narahin'ny fanitsiana ny sandan'ny p ho an'ny fampitahana marobe amin'ny fampiasana ny fomba Benjamini-Hochberg. H. Fanadihadiana fanatsarana ny proteinina izay maneho fahasamihafana be manerana ny proteome manontolo sy amin'ny fibre karazana 1 sy 2A. Ny fanadihadiana statistika dia natao tamin'ny fampiasana ny fonosana clusterProfiler sy ny sandan'ny p namboarina nataon'i Benjamini-Hochberg. I, J. Tetikasa fanadihadiana singa fototra (PCA) miloko amin'ny matrix extracellular sy ny ontolojian'ny fototarazo mitochondrial (GO).
Satria ny myopathies nemaline dia mety hisy fiantraikany amin'ny isan-jaton'ny karazana myofiber maneho MYH ao amin'ny hozatra skeletal,19,20 dia nodinihinay voalohany ny karazana myofiber maneho MYH amin'ny marary manana myopathies nemaline sy ny fanaraha-maso. Namaritra ny karazana myofiber izahay tamin'ny fampiasana fomba tsy mitanila izay voalaza teo aloha ho an'ny fanadihadiana myofiber 1000 (Sary fanampiny 10D–E) ary tsy nahomby indray ny namantatra ny myofibers 2X madio (Sary 6B). Nahita fiantraikany tsy mitovy amin'ny myopathies nemaline amin'ny karazana myofiber izahay, satria marary roa manana fiovan'ny ACTA1 no nanana ampahany betsaka kokoa amin'ny myofibers karazany 1, raha marary roa manana myopathy nemaline TNNT1 kosa no nanana ampahany kely kokoa amin'ny myofibers karazany 1 (Sary 6B). Eny tokoa, nihena ny fanehoana ny MYH2 sy ny isoforms troponin haingana (TNNC2, TNNI2, ary TNNT3) tamin'ny myopathie ACTA1-nemaline, raha nihena kosa ny fanehoana MYH7 tamin'ny myopathie TNNT1-nemaline (Sary Fanampiny 11A). Mifanaraka amin'ny tatitra teo aloha momba ny fiovan'ny karazana myofiber heterogeneous amin'ny myopathie nemaline izany.19,20 Nohamafisinay tamin'ny alalan'ny immunohistochemistry ireo valiny ireo ary hitanay fa ny marary voan'ny myopathie ACTA1-nemaline dia nanana myofibers karazany 1 betsaka kokoa, raha ny marary voan'ny myopathie TNNT1-nemaline kosa dia nanana lamina mifanohitra amin'izany (Sary 6A).
Amin'ny ambaratonga proteome misy fibre tokana, ny fibre hozatra avy amin'ny marary myopathy nemaline ACTA1 sy TNNT1 dia niangona niaraka tamin'ny ankamaroan'ny fibre fanaraha-maso, ary ny fibre myopathy nemaline TNNT1 amin'ny ankapobeny no tena voakasika indrindra (Sary 6C). Hita miharihary izany rehefa nampiseho ny tetika fanadihadiana singa fototra (PCA) momba ny fibre pseudo-inflated ho an'ny marary tsirairay, miaraka amin'ny marary myopathy nemaline TNNT1 2 sy 3 izay miseho lavitra indrindra amin'ny santionany fanaraha-maso (Sary Fanampiny 11B, Andian-drakitra Fanampiny 20). Mba hahatakarana bebe kokoa ny fomba fampitahana ny fibre avy amin'ny marary myopathy amin'ny fibre salama, dia nampiasa fampahalalana amin'ny antsipiriany azo avy amin'ny fanadihadiana proteomika amin'ny fibre 1.000 avy amin'ny mpandray anjara olon-dehibe salama izahay. Nasehonay tao amin'ny tetika PCA azo avy amin'ny fanadihadiana proteomika 1000-fibre (Sary 6D) ny fibre avy amin'ny angon-drakitra myopathy (marary myopathy nemaline ACTA1 sy TNNT1 sy ny fanaraha-maso) ny fibre avy amin'ny angon-drakitra myopathy (Sary 6D). Mitovy amin'ny fizarazarana fibre azo avy amin'ny fanadihadiana proteomika fibre 1000 ny fizarazarana ny karazana fibre amin'ny marary myopathie nemaline. Na izany aza, ny ankamaroan'ny fibre amin'ny marary myopathie nemaline dia nifindra nidina tamin'ny PC2, nifanindry tamin'ny fibre salama haingana, na inona na inona karazana fibre MYH niaviany. Noho izany, na dia naneho fiovana mankany amin'ny fibre karazany 1 aza ny marary myopathie nemaline ACTA1 rehefa nojerena tamin'ny alàlan'ny fomba mifototra amin'ny MYH, dia samy namindra ny proteome fibre hozatra skeletal mankany amin'ny fibre haingana ny myopathie nemaline ACTA1 sy ny myopathie nemaline TNNT1.
Avy eo dia nampitaha mivantana ny vondrona marary tsirairay tamin'ny olona salama izahay ary nahita proteinina 256 sy 552 samy hafa fanehoana ao amin'ny myopathie nemaline ACTA1 sy TNNT1 (Sary 6E–G sy Sary Fanampiny 11C, Andian-drakitra Fanampiny 21). Ny fanadihadiana momba ny fanatsarana ny fototarazo dia naneho fihenana mirindra amin'ny proteinina mitochondrial (Sary 6H–I, Andian-drakitra Fanampiny 22). Mahagaga fa na dia eo aza ny fahasamihafan'ny karazana fibre amin'ny myopathie nemaline ACTA1 sy TNNT1, ity fihenana ity dia tsy miankina tanteraka amin'ny karazana fibre mifototra amin'ny MYH (Sary 6H sy Sary Fanampiny 11D–I, Andian-drakitra Fanampiny 23). Proteinina mikraoba telo ihany koa no fehezina ao amin'ny myopathie nemaline ACTA1 na TNNT1. Roa amin'ireo microprotein ireo, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (fantatra ihany koa amin'ny hoe LINC00598 na Lnc-FOXO1) sy ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), no naneho fahasamihafana betsaka tamin'ny myofibers karazany 1 ihany. Ny ENSG00000215483_TR14_ORF67 dia voalaza fa mitana anjara toerana amin'ny fandrindrana ny tsingerin'ny sela. 56 Etsy ankilany, ny ENSG00000232046_TR1_ORF437 (mifanitsy amin'ny LINC01798) dia nitombo tamin'ny myofibers karazany 1 sy karazany 2A tao amin'ny myopathy ACTA1-nemaline raha oharina amin'ny olona salama (Sary Fanampiny 12A, Andian-drakitra Fanampiny 24). Mifanohitra amin'izany kosa, ny proteinina ribosomal dia tsy dia voakasiky ny myopathie nemaline, na dia nihena aza ny RPS17 tao amin'ny myopathie nemaline ACTA1 (Sary 6E).
Ny fanadihadiana momba ny fanatsarana ny hery fiarovana dia naneho ihany koa ny fiakaran'ny fizotran'ny hery fiarovana amin'ny myopathie nemaline ACTA1 sy TNNT1, raha nitombo ihany koa ny fifikiran'ny sela amin'ny myopathie nemaline TNNT1 (Sary 6H). Ny fanatsarana ireo singa ivelan'ny sela ireo dia hita taratra amin'ny fiovan'ny proteinina matrix extracellular PCA ao amin'ny PC1 sy PC2 amin'ny lalana ratsy (izany hoe, mankany amin'ireo fibre voakasika indrindra) (Sary 6J). Samy naneho fitomboan'ny fanehoana proteinina extracellular tafiditra amin'ny valin-kafatra ara-pahasalamana sy ny mekanisma fanamboarana sarcolemmal ireo vondrona marary roa, toy ny annexins (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 sy ny proteinina mifandray aminy S100A1159 (Sary Fanampiny 12B–C). Efa voalaza teo aloha fa nihatsara ity dingana ity tamin'ny dystrophies hozatra60 saingy, araka ny fahalalantsika, dia tsy mbola nifandray tamin'ny myopathie nemaline teo aloha. Ilaina ny fiasan'ity milina molekiola ity amin'ny fanamboarana sarcolemmal aorian'ny ratra ary amin'ny fampifangaroana ny myocytes vao niforona amin'ny myofibers58,61. Noho izany, ny fitomboan'ny asan'ity dingana ity amin'ny vondrona marary roa tonta dia manondro valinteny fanarenana amin'ny ratra vokatry ny tsy fahamarinan'ny myofiber.
Mifandray tsara ny vokatry ny myopathie nemaline tsirairay (r = 0.736) ary naneho fifanindriana mitombina (Sary Fanampiny 11A–B), izay manondro fa ny myopathie nemaline ACTA1 sy TNNT1 dia manana fiantraikany mitovy amin'ny proteome. Na izany aza, ny proteinina sasany dia voafehy amin'ny myopathie nemaline ACTA1 na TNNT1 ihany (Sary Fanampiny 11A sy C). Ny proteinina profibrotic MFAP4 no iray amin'ireo proteinina niakatra be indrindra tamin'ny myopathie nemaline TNNT1 saingy tsy niova tamin'ny myopathie nemaline ACTA1. Ny SKIC8, singa iray ao amin'ny complexe PAF1C tompon'andraikitra amin'ny fandrindrana ny fandikana ny fototarazo HOX, dia nihena tamin'ny myopathie nemaline TNNT1 saingy tsy voakasika tamin'ny myopathie nemaline ACTA1 (Sary Fanampiny 11A). Ny fampitahana mivantana ny myopathie nemaline ACTA1 sy TNNT1 dia naneho fihenana bebe kokoa amin'ny proteinina mitochondria sy fitomboan'ny proteinina ao amin'ny hery fiarovana ao amin'ny myopathie nemaline TNNT1 (Sary 6G–H sy Sary Fanampiny 11C sy 11H–I). Ireo angon-drakitra ireo dia mifanaraka amin'ny atrophy/dystrophy lehibe kokoa hita ao amin'ny myopathie nemaline TNNT1 raha oharina amin'ny myopathie nemaline TNNT1 (Sary 6A), izay manondro fa ny myopathie nemaline TNNT1 dia maneho endrika mafy kokoa amin'ny aretina.
Mba hanombanana raha toa ka maharitra amin'ny hozatra manontolo ny fiantraikan'ny myopathie nemaline hita, dia nanao fanadihadiana proteomika betsaka tamin'ny biopsie hozatra avy amin'ny andiany mitovy amin'ny marary myopathie nemaline TNNT1 izahay ary nampitaha azy ireo tamin'ny fanaraha-maso (n=3 isaky ny vondrona) (Sary Fanampiny 13A, Andian-drakitra Fanampiny 25). Araka ny nantenaina, mifandray akaiky amin'ny fanadihadiana singa fototra ny fanaraha-maso, raha toa kosa ka naneho fiovaovan'ny santionany ambony kokoa ny marary myopathie nemaline TNNT1 mitovy amin'ny hita amin'ny fanadihadiana fibre tokana (Sary Fanampiny 13B). Ny fanadihadiana betsaka dia namerina ireo proteinina samihafa fanehoana (Sary Fanampiny 13C, Andian-drakitra Fanampiny 26) sy ny dingana biolojika (Sary Fanampiny 13D, Andian-drakitra Fanampiny 27) izay nasongadina tamin'ny fampitahana ny fibre tsirairay, saingy very ny fahafahana manavaka ny karazana fibre samihafa ary tsy nahavita nanazava ny vokatry ny aretina samihafa amin'ny fibre.
Raha fintinina, ireo angon-drakitra ireo dia mampiseho fa ny proteomics myofiber tokana dia afaka manazava ireo endri-javatra ara-biolojika ara-pitsaboana izay tsy hita amin'ny fomba voafaritra toy ny immunoblotting. Ankoatra izany, ireo angon-drakitra ireo dia manasongadina ny fetran'ny fampiasana ny actin fiber typing (MYH) irery mba hilazana ny fampifanarahana phenotypic. Eny tokoa, na dia samy hafa aza ny fiovan'ny karazana fibre eo amin'ny actin sy ny troponin nemaline myopathies, dia samy manasaraka ny MYH fiber typing amin'ny metabolisman'ny fibre hozatra skeletal mankany amin'ny proteome hozatra haingana kokoa sy tsy dia oxidative.
Tena ilaina ny tsy fitoviana eo amin'ny sela mba hahafahan'ny sela mamaly ny filàny samihafa. Ao amin'ny hozatra, matetika izany dia faritana ho karazana fibre miavaka amin'ny ambaratonga samihafa amin'ny famokarana hery sy ny havizanana. Na izany aza, mazava fa ampahany kely amin'ny fiovaovan'ny fibre hozatra ihany no hazavain'izany, izay miovaova kokoa, sarotra ary maro lafy kokoa noho ny noheverina teo aloha. Ny fandrosoana ara-teknolojia ankehitriny dia manazava ireo anton-javatra mifehy ny fibre hozatra. Eny tokoa, ny angon-drakitray dia manondro fa ny fibre karazana 2X dia mety tsy ho karazana fibre hozatra miavaka. Ankoatra izany, dia namantatra ny proteinina metabolika, ny proteinina ribosomal ary ny proteinina mifandraika amin'ny sela ho toy ny antony lehibe mahatonga ny tsy fitoviana eo amin'ny fibre hozatra izahay. Amin'ny fampiharana ny fomba fiasan'ny proteomika amin'ny santionan'ny marary voan'ny myopathy nematode, dia nasehonay bebe kokoa fa ny karazana fibre mifototra amin'ny MYH dia tsy maneho tanteraka ny tsy fitoviana eo amin'ny hozatra, indrindra rehefa mikorontana ny rafitra. Eny tokoa, na inona na inona karazana fibre mifototra amin'ny MYH, ny myopathy nematode dia miteraka fifindrana mankany amin'ny fibre oxidative haingana kokoa sy tsy dia betsaka loatra.
Efa voasokajy hatramin'ny taonjato faha-19 ny fibra hozatra taolana. Ny fanadihadiana omics vao haingana dia namela antsika hanomboka hahatakatra ny mombamomba ny fanehoana ny karazana fibra MYH samihafa sy ny fihetsiny amin'ny fanentanana samihafa. Araka ny voalaza eto, ny fomba fiasa omics dia manana tombony amin'ny fahatsapana bebe kokoa amin'ny fandrefesana ny mari-pamantarana karazana fibra noho ny fomba nentim-paharazana mifototra amin'ny antibody, tsy miankina amin'ny fandrefesana ny mari-pamantarana tokana (na vitsivitsy) mba hamaritana ny karazana fibra hozatra taolana. Nampiasa fomba fiasa transcriptomic sy proteomic mifameno izahay ary nampiditra ny valiny mba handinihana ny fandikana sy ny fandrindrana aorian'ny fandikana ny tsy fitoviana amin'ny fibra ao amin'ny fibra hozatra taolana olombelona. Io fomba fiasa io dia niafara tamin'ny tsy fahombiazana hamantatra ny fibra karazana 2X madio amin'ny ambaratonga proteinina ao amin'ny vastus lateralis an'ny andiana tovolahy salama. Mifanaraka amin'ny fanadihadiana fibra tokana teo aloha izay nahita fibra 2X madio <1% ao amin'ny vastus lateralis salama, na dia tokony hohamafisina amin'ny hozatra hafa amin'ny ho avy aza izany. Ny tsy fitoviana eo amin'ny fahitana fibra 2X saika madio amin'ny ambaratonga mRNA sy ny fibra 2A/2X mifangaro amin'ny ambaratonga proteinina dia mahagaga. Tsy circadian ny fanehoana ny mRNA isoform MYH,67 izay milaza fa tsy azo inoana fa "tsy nahita" ny famantarana fanombohan'ny MYH2 isika amin'ny fibre 2X toa madio amin'ny ambaratonga RNA. Ny fanazavana iray mety hitranga, na dia vinavinaina fotsiny aza, dia mety ho ny fahasamihafan'ny fahamarinan'ny proteinina sy/na ny mRNA eo amin'ny isoform MYH. Eny tokoa, tsy misy fibre haingana 100% madio ho an'ny isoform MYH rehetra, ary tsy mazava raha toa ka hiteraka habetsahan'ny MYH1 sy MYH2 mitovy amin'ny ambaratonga proteinina ny haavon'ny fanehoana ny mRNA MYH1 amin'ny elanelana 70–90%. Na izany aza, rehefa mandinika ny transcriptome na proteome manontolo, ny fanadihadiana cluster dia afaka mamantatra amim-pahatokiana ny cluster roa miavaka izay maneho ny fibre hozatra miadana sy haingana, na inona na inona firafitry ny MYH marina. Mifanaraka amin'ny fanadihadiana mampiasa fomba fiasa transcriptomic tokana-nokleary izany, izay mazàna mamantatra cluster myonuclear roa miavaka ihany. 68, 69, 70 Ankoatra izany, na dia efa namantatra ireo fibre karazany 2X aza ireo fanadihadiana momba ny proteômika teo aloha, ireo fibre ireo dia tsy miangona misaraka amin'ireo fibre haingana hafa ary mampiseho proteinina vitsy dia vitsy izay samy hafa be raha oharina amin'ny karazana fibre hafa mifototra amin'ny MYH. 14 Ireo valiny ireo dia manoro hevitra fa tokony hiverina amin'ny fomba fijery tany am-piandohan'ny taonjato faha-20 momba ny fanasokajiana ny fibre hozatra isika, izay nizara ny fibre hozatra taolana olombelona tsy ho kilasy telo miavaka mifototra amin'ny MYH, fa ho vondrona roa mifototra amin'ny toetrany metabolika sy ny fihenjanana. 63
Ny tena zava-dehibe kokoa dia ny tokony hojerena amin'ny lafiny maro ny tsy fitoviana eo amin'ny myofiber. Ny fanadihadiana "omics" teo aloha dia nanondro io lalana io, izay milaza fa ny fibra hozatra dia tsy mamorona vondrona misaraka fa milahatra araka ny fitohizana. 11, 13, 14, 64, 71 Eto, asehonay fa, ankoatra ny fahasamihafan'ny toetran'ny hozatra mifampitohy sy mifampitohy, ny myofiber dia azo avahana amin'ny alàlan'ny endri-javatra mifandraika amin'ny fifandraisan'ny sela sy ny mekanisma fandikan-teny. Eny tokoa, nahita ny tsy fitoviana eo amin'ny ribosome amin'ny fibra hozatra izahay izay mandray anjara amin'ny tsy fitoviana tsy miankina amin'ny karazana fibra miadana sy haingana. Ny antony fototra mahatonga ity tsy fitoviana eo amin'ny myofiber ity, tsy miankina amin'ny karazana fibra miadana sy haingana, dia mbola tsy mazava, saingy mety manondro fandaminana ara-toerana manokana ao anatin'ny fascicles hozatra izay mamaly tsara ny hery sy ny enta-mavesatra manokana,72 fifandraisana manokana amin'ny sela na taova amin'ny karazana sela hafa ao amin'ny tontolo manodidina ny hozatra73,74,75 na ny fahasamihafan'ny asan'ny ribosome ao anatin'ny myofiber tsirairay. Eny tokoa, ny heteroplasmie ribosomal, na amin'ny alàlan'ny fanoloana paralogous an'ny RPL3 sy RPL3L na amin'ny ambaratongan'ny 2′O-methylation an'ny rRNA, dia naseho fa mifandray amin'ny hypertrophy hozatra skeletal76,77. Ny fampiharana multi-omic sy spatial miaraka amin'ny famaritana ny asan'ny myofibers tsirairay dia hampandroso bebe kokoa ny fahatakarantsika ny biolojian'ny hozatra amin'ny ambaratonga multi-omic78.
Tamin'ny famakafakana ny proteome amin'ny myofibers tokana avy amin'ny marary voan'ny myopathies nemaline, dia nasehonay ihany koa ny fampiasana, ny fahombiazany ary ny fampiharana ny proteomics myofiber tokana mba hanazavana ny pathophysiology klinika amin'ny hozatra skeletal. Ankoatra izany, tamin'ny fampitahana ny fomba fiasanay amin'ny fanadihadiana proteomika manerantany, dia afaka nampiseho izahay fa ny proteomics myofiber tokana dia manome halaliny fampahalalana mitovy amin'ny proteomics sela manerantany ary manitatra io halaliny io amin'ny alàlan'ny fiheverana ny tsy fitoviana eo amin'ny fibre sy ny karazana myofiber. Ho fanampin'ny fahasamihafana andrasana (na miovaova aza) amin'ny tahan'ny karazana fibre hita amin'ny myopathies nemaline ACTA1 sy TNNT1 raha oharina amin'ny olona salama,19 dia nahita fanavaozana oxidative sy extracellular ihany koa izahay tsy miankina amin'ny fiovan'ny karazana fibre MYH. Efa nisy tatitra momba ny fibrosis tamin'ny myopathies nemaline TNNT1.19 Na izany aza, ny fanadihadianay dia miorina amin'io zavatra hita io amin'ny alàlan'ny fampisehoana ihany koa ny fitomboan'ny haavon'ny proteinina mifandraika amin'ny fihenjanana ateraky ny sela ivelan'ny sela, toy ny annexins, izay tafiditra amin'ny mekanisma fanamboarana sarcolemmal, ao amin'ny myofibers avy amin'ny marary voan'ny myopathies nemaline ACTA1 sy TNNT1.57,58,59 Ho famaranana, ny fitomboan'ny haavon'ny annexin ao amin'ny myofibers avy amin'ny marary voan'ny myopathy nemaline dia mety maneho valinteny sela amin'ny fanamboarana ny myofibers atrofi mafy.
Na dia maneho ny fanadihadiana lehibe indrindra momba ny hozatra manontolo amin'ny fibre tokana aza ity fandalinana ity hatramin'izao, dia tsy hoe tsy misy fetrany izany. Nanavaka ny fibre hozatra avy amin'ny santionany kely sy mitovy amin'ny mpandray anjara sy hozatra tokana (ny vastus lateralis) izahay. Noho izany, tsy azo atao ny manilika ny fisian'ny fibre manokana amin'ny karazana hozatra rehetra sy amin'ny fara tampony amin'ny fiziolojian'ny hozatra. Ohatra, tsy afaka manilika ny mety hisian'ny fibre ultrafast (ohatra, fibre 2X madio) mipoitra amin'ny mpihazakazaka efa voaofana tsara sy/na atleta matanjaka79 na mandritra ny vanim-potoana tsy fiasan'ny hozatra66,80. Ankoatra izany, ny haben'ny santionany voafetra amin'ny mpandray anjara dia nanakana anay tsy hanadihady ny fahasamihafan'ny lahy sy ny vavy amin'ny tsy fitoviana amin'ny fibre, satria fantatra fa samy hafa ny tahan'ny karazana fibre eo amin'ny lehilahy sy ny vehivavy. Ankoatra izany, tsy afaka nanao fanadihadiana transcriptomic sy proteomic tamin'ny fibre hozatra mitovy na santionany avy amin'ny mpandray anjara mitovy izahay. Eo am-panohizanay sy ny hafa manatsara ny fanadihadiana sela tokana sy myofiber tokana amin'ny alàlan'ny fanadihadiana omics mba hahazoana fidirana santionany ambany dia ambany (araka ny aseho eto amin'ny fanadihadiana ny fibre avy amin'ny marary voan'ny myopathy mitochondrial), dia miharihary ny fahafahana mampifangaro fomba fiasa multi-omics (sy miasa) ao anatin'ny fibre hozatra tokana.
Amin'ny ankapobeny, ny angon-drakitray dia mamantatra sy manazava ny antony mahatonga ny tsy fitoviana eo amin'ny hozatra skeletal amin'ny alalan'ny fandikana sy aorian'ny fandikana. Manolotra angon-drakitra manokana izahay izay manohitra ny dogma efa ela momba ny fiziolojian'ny hozatra skeletal mifandraika amin'ny famaritana mahazatra momba ny karazana fibre mifototra amin'ny MYH. Manantena izahay fa hanavao ny adihevitra ary handinika indray ny fahatakarantsika ny fanasokajiana sy ny tsy fitoviana eo amin'ny fibre hozatra skeletal.
Mpandray anjara fotsy hoditra efatra ambin'ny folo (lehilahy 12 sy vehivavy 2) no nanaiky an-tsitrapo handray anjara amin'ity fandalinana ity. Neken'ny Komitin'ny Etika ao amin'ny Hopitaly Oniversiten'i Ghent (BC-10237) ny fandalinana, nanaraka ny Fanambarana Helsinki tamin'ny 2013, ary voasoratra anarana tao amin'ny ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Aseho ao amin'ny Tabilao Fanampiny 1 ny toetra ankapoben'ireo mpandray anjara. Rehefa avy nahazo fanekena am-bava sy an-tsoratra, dia nandalo fizahana ara-pitsaboana ireo mpandray anjara talohan'ny fampidirana farany azy ireo tao amin'ny fandalinana. Tanora (22–42 taona) ireo mpandray anjara, salama tsara (tsy misy aretina, tsy misy tantaran'ny fifohana sigara), ary mavitrika ara-batana antonony. Ny fandraisana oksizenina ambony indrindra dia voafaritra tamin'ny fampiasana ergometer dingana mba hanombanana ny fahasalamana ara-batana araka ny voalaza teo aloha. 81
Intelo no nangonina ny santionan'ny biopsy hozatra rehefa niala sasatra sy nifady hanina, izay samy nisy elanelany 14 andro. Satria nangonina ho anisan'ny fandalinana lehibe kokoa ireo santionany ireo, dia nihinana placebo (lactose), mpanohitra ny mpandray H1 (540 mg fexofenadine), na mpanohitra ny mpandray H2 (40 mg famotidine) ireo mpandray anjara 40 minitra talohan'ny biopsy. Efa nasehonay teo aloha fa ireo mpanohitra ny mpandray histamine ireo dia tsy misy fiantraikany amin'ny fahasalaman'ny hozatra rehefa miala sasatra81, ary tsy nisy fitambarana mifandraika amin'ny toe-javatra hita tao amin'ny teti-pifehezanay momba ny kalitao (Sary Fanampiny 3 sy 6). Sakafo manara-penitra (41.4 kcal/kg lanjan'ny vatana, gliosida 5.1 g/kg lanjan'ny vatana, proteinina 1.4 g/kg lanjan'ny vatana, ary tavy 1.6 g/kg lanjan'ny vatana) no nohazonina nandritra ny 48 ora talohan'ny andro fanandramana tsirairay, ary sakafo maraina manara-penitra (gliosida 1.5 g/kg lanjan'ny vatana) nohanina ny marainan'ny andro fanandramana. Teo ambanin'ny fanatoranana eo an-toerana (0.5 ml 1% lidocaine tsy misy epinephrine), dia nalaina avy amin'ny hozatra vastus lateralis ny biopsie hozatra tamin'ny alàlan'ny fampiasana ny fanesorana Bergström amin'ny hoditra.82 Napetraka avy hatrany tao amin'ny RNA ny santionan'ny hozatra ary notehirizina tamin'ny 4°C mandra-pahatongan'ny fandidiana fanesorana ny fibra amin'ny tanana (hatramin'ny 3 andro).
Nafindra tany amin'ny fitaovana RNAlater vaovao tao anaty lovia fambolena ireo fehezam-bolo myofiber vao avy nosarahina. Avy eo dia notapatapahina tamin'ny tanana ireo myofiber tsirairay tamin'ny fampiasana stereomicroscope sy tweezers manify. Notapatapahina tamin'ny biopsy tsirairay ny kofehy dimy amby roapolo, ary nojerena manokana ny fisafidianana kofehy avy amin'ny faritra samihafa amin'ny biopsy. Rehefa avy notapatapahina, dia natsoboka moramora tao anaty lysis buffer 3 μl (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) misy anzima proteinase K sy DNase ny kofehy tsirairay mba hanesorana ireo proteinina sy ADN tsy ilaina. Natomboka tamin'ny alalan'ny vortexing fohy, ny fihodinana ny ranon-javatra tao anaty microcentrifuge, ary ny incubation tamin'ny mari-pana efitrano (10 minitra) ny lysate. Avy eo dia notapatapahina tao anaty thermal cycler (T100, Bio-Rad) tamin'ny 37°C nandritra ny 5 minitra, 75°C nandritra ny 5 minitra, ary avy eo dia notehirizina avy hatrany tamin'ny -80°C mandra-pahatongan'ny fanodinana fanampiny.
Nomanina avy amin'ny lysate myofiber 2 µl ny tranomboky RNA polyadenylated mifanaraka amin'ny Illumina tamin'ny fampiasana ny QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Azo jerena ao amin'ny bokin'ny mpanamboatra ny fomba amin'ny antsipiriany. Manomboka amin'ny fananganana cDNA kofehy voalohany amin'ny alàlan'ny fandikana mivadika ny dingana, izay ampidirina ny famantarana molekiola tokana (UMI) sy ny barcode i1 manokana ho an'ny santionany mba hahazoana antoka ny fampivondronana ny santionany sy hampihenana ny fiovaovan'ny teknika mandritra ny fanodinana manaraka. Avy eo dia atambatra sy diovina amin'ny vakana magnetika ny cDNA avy amin'ny myofibers 96, aorian'izay dia esorina ny RNA ary atao ny fananganana kofehy faharoa amin'ny alàlan'ny primer kisendrasendra. Diovina amin'ny vakana magnetika ny tranomboky, ampiana marika i5/i7 manokana ho an'ny dobo, ary ampitomboina ny PCR. Ny dingana fanadiovana farany dia mamokatra tranomboky mifanaraka amin'ny Illumina. Ny kalitaon'ny dobo tranomboky tsirairay dia nodinihina tamin'ny fampiasana ny High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Mifototra amin'ny fandrefesana Qubit, dia natambatra bebe kokoa tamin'ny fifantohana equimolar (2 nM) ireo dobo. Avy eo dia nojerena ny filaharan'ny dobo vokarina tamin'ny fitaovana NovaSeq 6000 tamin'ny fomba mahazatra tamin'ny fampiasana ny NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 nucleotides) miaraka amin'ny 2 nM loading (4% PhiX).
Mifototra amin'ny fantsona famakafakana angon-drakitra QuantSeq Pool an'ny Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) ny fantsonay. Nesorina voalohany tamin'ny bcl2fastq2 (v2.20.0) ny angon-drakitra mifototra amin'ny index i7/i5. Avy eo dia noesorina tamin'ny idemux (v0.1.6) ny Read 2 mifototra amin'ny barcode santionany i1 ary nalaina tamin'ny umi_tools (v1.0.1) ny sequence UMI. Notapatapahina tamin'ny cutadapt (v3.4) imbetsaka ny famakiana mba hanesorana ny famakiana fohy (<20 ny halavany) na ny famakiana izay ahitana sequence adaptatera fotsiny. Avy eo dia nampifanarahina tamin'ny genome olombelona ny famakiana tamin'ny fampiasana STAR (v2.6.0c) ary nosokajiana tamin'ny SAMtools (v1.11) ny rakitra BAM. Nesorina tamin'ny fampiasana umi_tools (v1.0.1) ny famakiana mitovy. Farany, natao tamin'ny fampiasana featureCounts ao amin'ny Subread (v2.0.3) ny fanisana ny alignment. Natao tamin'ny alalan'ny FastQC (v0.11.9) ny fanaraha-maso ny kalitao tamin'ny dingana maromaro teo anelanelan'ny fantsona.
Natao tao amin'ny R (v4.2.3) ny fanodinana sy ny fijerena ny bioinformatika rehetra, indrindra tamin'ny fampiasana ny fomba fiasan'ny Seurat (v4.4.0). 83 Noho izany, ny sandan'ny UMI tsirairay sy ny matrice metadata dia novaina ho zavatra Seurat. Nesorina ireo fototarazo hita ao amin'ny latsaky ny 30% amin'ny fibre rehetra. Nesorina ireo santionany ambany kalitao mifototra amin'ny tokonam-baravarana farafahakeliny 1000 UMI sy fototarazo hita 1000. Tamin'ny farany, ny fibre 925 dia nandalo ny dingana rehetra momba ny fanaraha-maso ny kalitao. Nohavaozina ny sandan'ny UMI tamin'ny fampiasana ny fomba Seurat SCTransform v2, 84 anisan'izany ny endri-javatra hita rehetra 7418, ary nesorina ny fahasamihafana teo amin'ny mpandray anjara. Ny metadata rehetra mifandraika amin'izany dia hita ao amin'ny Dataset Fanampiny 28.
Fotoana fandefasana: 10 Septambra 2025